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EZ ECL Pico化學(xué)發(fā)光液(皮克級)使用說明書

發(fā)布時間:2017/11/15      點(diǎn)擊次數(shù):1883

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EZ ECL Pico化學(xué)發(fā)光液(皮克級)

產(chǎn)品名稱

貨號

規(guī)格

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價格(元)

EZ ECL Pico化學(xué)發(fā)光液(皮克級)

D3030L1262

100 mL 

4℃

500

 

產(chǎn)品描述

EZ ECL Pico化學(xué)發(fā)光液是一款增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(ECL)HRP底物,可幫助用戶在免疫印跡分析過程中實(shí)現(xiàn)低皮克級的蛋白檢測(<10-12g),極其節(jié)省抗體。本產(chǎn)品一抗?jié)舛确秶?/span>0.2-0.1μg/ml(以1 µg/mL儲存液稀釋1:1,000至1:5,000倍);二抗?jié)舛?0-50ng/ml(以1 mg/mL儲存液稀釋1:20,000至1:100,000倍)。

EZ Pico底物,為使用辣根過氧化物酶(HRP)偶聯(lián)物的免疫印跡實(shí)驗提供了明亮的信號、低至皮克級檢測靈敏度。該ECL底物能夠兼容各種膜、封閉液和寬范圍抗體稀釋液,以出色性能、通用性和高性價比,滿足用戶的免疫印跡應(yīng)用需求。

EZ Pico底物的特點(diǎn):

• ECL — 用于辣根過氧化物酶(HRP)的增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光底物

• 低至皮克級靈敏度 — 檢測硝化纖維素膜或PVDF膜上皮克級的蛋白條帶

• 長信號持續(xù)時間 — 在條件優(yōu)化情況下,經(jīng)底物孵育的印跡條帶能夠持續(xù)輸出6至8小時的可檢測光信號

• 穩(wěn)定試劑 — 工作液在24小時內(nèi)保持穩(wěn)定;試劑盒在室溫下可穩(wěn)定放置長達(dá)1年

• 價格經(jīng)濟(jì) — 針對稀釋的抗體濃度條件進(jìn)行了優(yōu)化:

本產(chǎn)品優(yōu)于SuperSignal™ West Pico Chemiluminescent Substrate,West Pico為Thermo Fisher公司產(chǎn)品(CAT:34077-34080)

運(yùn)輸與保存方法

 室溫運(yùn)輸,4℃避光保存,質(zhì)保期大于12個月。

產(chǎn)品組分

組分名稱

產(chǎn)品貨號規(guī)格及組分

D3030L1262(100ml)

D3030L1263(500ml)

A液

50ml

250ml

B液

50ml

250ml

使用方法

1. 按常規(guī)方法執(zhí)行常規(guī)電泳、轉(zhuǎn)膜、HRP標(biāo)記抗體或者HRP標(biāo)記核酸探針孵育、洗膜。

注:優(yōu)化抗原和抗體的濃度。必須使用建議的抗體稀釋度,以保證陽性結(jié)果。將一抗?jié)舛认♂尩?.2~1ug/ml,將二抗?jié)舛认♂尩?0~50ng/mL(*稀釋度取決于一抗和膜上的抗原量)。

2. 新鮮配制發(fā)光工作液:根據(jù)用量將兩種組份按1:1比例混合均勻,備用。

注: 1) 短時間暴露于日光燈下不會損害該工作液,但為獲得*結(jié)果,將此工作液保存在棕色瓶中,避免暴露于任何強(qiáng)光。

2) 取A液和B液一定要用不同的槍頭,工作液現(xiàn)配現(xiàn)用,室溫放置數(shù)小時后仍可使用但靈敏度略有降低。

3. 用平頭鑷取出膜,搭在濾紙上瀝干洗液,勿使膜*干燥。用移液器將工作液加到膜上(推薦100μl發(fā)光液/cm2膜),使之充分接觸。室溫孵育5分鐘,準(zhǔn)備立即壓片曝光。

4. 用平頭鑷子夾起膜,膜的下緣輕輕接觸吸水紙,去除膜上多余的液體,留下少量工作液,不可讓膜*干燥。

5. 在X光膠片暗盒內(nèi)表面鋪一張面積大于膜的保鮮膜。將印跡膜貼在保鮮膜上,將保鮮膜折起來*包裹印跡膜,去除氣泡和皺褶,可剪去邊緣部多余的保鮮膜。用濾紙吸去多余的發(fā)光工作液。用膠帶將覆蓋印跡膜的保鮮膜固定在暗盒內(nèi),蛋白條帶面向上。

6將X光膠片置于膜的上面。建議*次曝光60秒。之后可調(diào)整曝光時間以達(dá)到*結(jié)果?;瘜W(xué)發(fā)光反應(yīng)在底物孵育后的前5-30分鐘期間是zui強(qiáng)烈的。這一反應(yīng)可以持續(xù)幾個小時,但強(qiáng)度會隨時間下降,如底物孵育較長時間后曝光,曝光時間可能需要延長以獲得較強(qiáng)信號。如果使用磷光存儲成像設(shè)備(如Bio-Rad的分子成像儀系統(tǒng))或CCD照相機(jī)可能需要較長的曝光時間。

注意:膠片與膜之間的任何相對移動,可能在膠片上造成人為的非特異信號。

7使用合適的顯影劑和定影劑對膠片進(jìn)行顯影。如果信號太強(qiáng),則縮短曝光時間或?qū)⒂∮浤みM(jìn)行剝離并降低抗體濃度重新檢測。

常見問題及解決方案

問題

可能問題

解決方案

膠片反轉(zhuǎn)像(即黑色背景,白色帶)

系統(tǒng)中HRP過多

將HRP標(biāo)記二抗稀釋至少10倍

膜上有褐色或黃色帶

印記在暗室中發(fā)光

信號持續(xù)時間少于8小時

信號弱或無信號

系統(tǒng)中過多的HRP耗盡了底物并導(dǎo)致信號迅速衰減

將HRP標(biāo)記二抗稀釋至少10倍

抗原或抗體的量不足

增加抗體或抗原的量

蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移率低

優(yōu)化轉(zhuǎn)印

HRP或底物活性低

見下文注釋

高背景

系統(tǒng)中HRP過多

將HRP標(biāo)記二抗稀釋至少10倍

封閉不充分

優(yōu)化封閉條件

封閉式機(jī)不合適

嘗試一種不同的封閉試劑

洗滌不充分

增加洗滌時間、次數(shù)或洗滌緩沖液體積

膠片過度曝光

縮短曝光時間或使用背景消除劑

抗原或抗體的濃度太高

減少抗體或抗原的量

蛋白質(zhì)條內(nèi)有斑點(diǎn)

蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜效率低

優(yōu)化轉(zhuǎn)印流程

膜的水化不均勻

按照制造商建議適度的使膜水化

膠片與膜之間存在氣泡

在膠片曝光前,去除氣泡

膠片上背景有斑點(diǎn)

HRP標(biāo)記二抗中存在聚集物

使用0.2um的過濾器

非特異性條帶

系統(tǒng)中HRP過多

將HRP標(biāo)記二抗稀釋至少10倍。

SDS導(dǎo)致的蛋白非特異性結(jié)合

在檢測過程中不使用SDS

檢測系統(tǒng)有效性(如需要):在暗室中,在一個清潔試管中加入將1-2ml底物工作液。關(guān)閉燈,添加1ul未稀釋的HRP標(biāo)記二抗工作液。該溶液應(yīng)當(dāng)立即發(fā)出藍(lán)色光,藍(lán)光信號在隨后的幾分鐘漸淡。

注意事項

(1)步驟1~5可在日光燈下操作;但發(fā)光液曝露于強(qiáng)光下時間過久靈敏度可能略有降低,移到暗房操作可避免之。戴手套可以避免在膜上留下手印。

(2)長時間曝光或蛋白過量,將加深背景并使條帶強(qiáng)弱變化失去線性關(guān)系。曝光不足則條帶模糊。

(3)發(fā)光工作液孵育約3分鐘后膜上的條帶發(fā)光。強(qiáng)條帶發(fā)光在暗房中肉眼可見,低豐度蛋白條帶發(fā)光較弱甚至肉眼不可見但可使X光膠片曝光。不能簡單以肉眼觀察判斷條帶發(fā)光時間。肉眼不可見的熒光實(shí)際上可持續(xù)數(shù)小時并使X光膠片感光,因而弱帶可曝光1-10小時。如果曝光后條帶不佳,可用洗膜緩沖液洗膜,重新孵育二抗,然后重新用ECL發(fā)光和曝光。

(4)由于超敏發(fā)光液極其靈敏,強(qiáng)烈推薦大多數(shù)進(jìn)口抗體起始濃度為一抗1:1000~1:4000,二抗1:2000~1:5000??贵w濃度過高將造成高背景或沒有條帶,導(dǎo)致失敗。

(5)某些保鮮膜包裹印跡膜時可能會淬滅熒光,應(yīng)選擇高質(zhì)量保鮮膜。

(6)使用肉眼可見的預(yù)染色蛋白Marker和熒光-放射自顯影曝光標(biāo)簽可確定膠片上條帶的位置和大小。

(7)NaN3能抑制HRP活性,回收第二抗體應(yīng)避免使用NaN3,如必需使用勿超過0.01%。

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