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Collagenase, TypeI 膠原酶I型

消化法中常使用的酶有3種：胰蛋白酶、膠原酶以及透明質(zhì)酸酶，透明質(zhì)酸酶多數(shù)情況下與胰蛋白酶或膠原酶聯(lián)合應(yīng)用；胰蛋白酶作用較強(qiáng)，容易造成平滑肌細(xì)胞損壞；膠原酶作用較緩和，能消化細(xì)胞間質(zhì)中的膠原纖維以釋放細(xì)胞，對細(xì)胞損傷小，是*一種可以降解具有三股超螺旋結(jié)構(gòu)的天然膠原纖維的蛋白酶。

膠原酶(Collagenase)從溶組織梭菌（Clostridium histolyticum）提取的一種酶粗提物，也叫梭菌蛋白酶A（clostridiopeptidase A），不僅含有膠原酶，還含有其他的一些蛋白酶、多糖酶、脂酶等。這些成分分別能夠有效水解結(jié)締組織和上皮組織細(xì)胞外基質(zhì)內(nèi)的其他蛋白，多糖和脂質(zhì)。該酶分離效果好，即使有鈣、鎂離子存在仍有活性，故可用PBS和含血清的培養(yǎng)液配制，既操作簡便又可提高細(xì)胞成活率，zui終濃度200u/mL，此酶消化作用緩和，無需機(jī)械振蕩。

目前商業(yè)化提供的細(xì)菌膠原酶主要根據(jù)膠原酶活性的差異，分為四種類型：膠原酶I型，II型，III型和IV型，在應(yīng)用上有所偏向：1）膠原酶I（Type I Collagenase）：含有比較均勻的各種酶活力（包括膠原酶、酪蛋白酶、梭菌蛋白酶、胰蛋白酶活性）。通常用作上皮細(xì)胞、肝、肺、脂肪和腎上腺組織細(xì)胞的制備；2）膠原酶II（Type II Collagenase）：含有更高的梭菌蛋白酶活性，通常用于心臟、骨、肌肉、胸腺和軟骨等組織來源細(xì)胞的制備；3）膠原酶III（Type III Collagenase）：含有較低的蛋白酶活性，常用于乳腺細(xì)胞的制備；4）膠原酶IV（Type IV Collagenase）：含有低胰酶活性，通常用于胰島細(xì)胞的制備，或者需要維持受體完整性的細(xì)胞制備實(shí)驗(yàn)。

使用方法

1. 膠原酶儲存液的配制

向每管100mg的膠原酶中加入100µL的含Ca2+、Mg2+的HBSS（Hank’s平衡鹽溶液，含Ca2+、Mg2+），輕輕旋渦震蕩使其充分溶解，制備成1g/ml（即1000×）的儲存液。然后用低蛋白結(jié)合性的0.22μm的濾膜過濾除菌，分裝成小份量，然后于-20℃避光凍存。

使用前于冰上解凍，避免反復(fù)凍融。其用于組織和細(xì)胞分散的常用濃度為：0.5-2.5mg/ml，用于軟骨消化的常用濃度為1-2mg/ml，需要根據(jù)特定的實(shí)驗(yàn)條件或者參考相應(yīng)的文獻(xiàn)資料確定所需的*工作濃度。

2．組織的分離

1）使用無菌手術(shù)刀或剪刀將組織切成3-4mm大小的組織塊；

2）利用含Ca2+、Mg2+的HBSS洗滌組織塊數(shù)次；

3）加入足量的含Ca2+、Mg2+的HBSS，使其浸沒組織塊，并加入膠原酶至需要工作濃度；

4）于37℃孵育4-18h。消化時使用水平搖床以及用3mM的CaCl2補(bǔ)充消化可以提高消化效率。

5） 已分散開的細(xì)胞可使用不銹鋼或尼龍網(wǎng)篩篩得，收集備用。未*解離的組織另外添加適量的新鮮膠原酶工作液于37℃繼續(xù)孵育；

6）利用不含膠原酶的HBSS洗滌收集的細(xì)胞數(shù)次；

7）細(xì)胞培養(yǎng)液重懸上述細(xì)胞，利用自動細(xì)胞計(jì)數(shù)器或其他方法計(jì)算活細(xì)胞密度。

8）于細(xì)胞培養(yǎng)皿上利用合適細(xì)胞培養(yǎng)基接種細(xì)胞。

3． 器官灌注

1）向37℃預(yù)熱的含Ca2+、Mg2+的HBSS中加入膠原酶，另添加3mM的CaCl2有助于提高分離效率；

2）按照已優(yōu)化的速率對相應(yīng)的器官灌注膠原酶工作液；

3）將上述過程中回收的灌注液流經(jīng)不銹鋼或尼龍網(wǎng)篩，從而將已解離的細(xì)胞或小片段組織塊與較大團(tuán)塊分離開來，未充分解離的組織需利用新鮮膠原酶工作液于37℃進(jìn)一步孵育；

4）利用不含膠原酶的HBSS洗滌收集的細(xì)胞數(shù)次；

5）細(xì)胞培養(yǎng)液重懸上述細(xì)胞，利用自動細(xì)胞計(jì)數(shù)器或其他方法計(jì)算活細(xì)胞密度。

6）于細(xì)胞培養(yǎng)皿上利用合適細(xì)胞培養(yǎng)基接種細(xì)胞。