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高保真DNA聚合酶的使用方案

更新時(shí)間:2018-07-23      點(diǎn)擊次數(shù):1449
  高保真DNA聚合酶可在離體條件下,以DNA為模板,延伸引物,合成雙鏈 DNA。這個(gè)酶只有5′→3′DNA聚合酶活性和 5′→3′的外切酶活性,缺少 3′→5′的外切酶活性,即具有 5’-3’DNA 聚合酶活性和對(duì)雙鏈 DNA 特異的 5’-3’外切核酸酶活性,無(wú) 3’-5’ 外切酶活性。使用該產(chǎn)品擴(kuò)增得到的 PCR 產(chǎn)物的 3’末端附有一個(gè)“A”堿基,可直接用于 TA 克隆。
由于不具有 3'-5'外切酶活性,因而在合成中對(duì)某些單核苷酸錯(cuò)配沒(méi)有校正功能。還具有非模板依賴(lài)性活性,可將PCR雙鏈產(chǎn)物的每一條鏈 3'加入單核苷酸尾,故可使PCR產(chǎn)物具有3'突出的單A核苷酸尾。另一方面,在僅有dTTP存在時(shí),它可將平端的質(zhì)粒的3'端加入單T核苷酸尾,產(chǎn)生 3'端突出的單 T 核苷酸尾。應(yīng)用這一特性,可實(shí)現(xiàn) PCR 產(chǎn)物的 T-A 克隆法。適用于,普通PCR,TA 克隆 Super Taq DNA 聚合酶 Super Taq DNA 聚合酶是由耐熱的 Taq DNA 聚合酶和具有 3’-5’外切酶活性的高保真 DNA 聚合酶按照合適的比例混合而成,具有擴(kuò)增效率高和錯(cuò)配率低的優(yōu)良性能,使用該 產(chǎn)品擴(kuò)增得到的 PCR 產(chǎn)物的 3’末端附有一個(gè)“A”堿基,可直接用于 TA 克隆。
  高保真DNA聚合酶產(chǎn)品描述,本酶為Pyrococcus furiosus中分離的pfu DNA pol基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)后經(jīng)多步純化分離而得。Pfu DNA聚合酶具有3′→5′外 切酶(校正)活性,當(dāng)聚合反應(yīng)發(fā)生堿基錯(cuò)配時(shí),聚合酶的校正活性可將錯(cuò)配的堿基切除。Pfu DNA聚合酶為使用范圍廣的高保真DNA聚合酶,其錯(cuò)誤率僅為1.3x10-6,推薦Pfu DNA聚合酶用于需高保真的PCR反應(yīng)。產(chǎn)品用途,用于要求保真度比較高的PCR反應(yīng),包括克隆PCR、DNA片段拼接、引入突變、全基因合成,DNA片段的補(bǔ)平等(參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)方案)。使用建議:Pfu DNA聚合酶產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物為平滑末端,無(wú)3′端"A"突出,其PCR產(chǎn) 物的克隆有幾種方案。
  高保真DNA聚合酶主要特性,此酶早在大腸桿菌中發(fā)現(xiàn),以后陸續(xù)在其他原核生物及微生物中找到。這類(lèi)酶的共同性質(zhì)是,以脫氧核苷酸三磷酸(dNTP)為前體催化合成DNA。需要模板和引物的存在。不能起始合成新的DNA鏈。催化dNTP加到生長(zhǎng)中的DNA鏈的3'-OH末端。催化DNA合成的方向是5'→3'。PCR前引物進(jìn)行5′端加磷修飾或?qū)CR產(chǎn)物磷酸化處理后再直接克隆 于平滑末端的載體中(參見(jiàn)實(shí)驗(yàn)方案)引物中引入15bp與載體同源序列,利用 PCR產(chǎn)物一步定向無(wú)縫克隆試劑盒(Cat# NR001)直接連接到目的載體。pfu DNA聚合酶由于Pfu DNA聚合酶的校對(duì)活性可引起引物從3′端被部分降解。因此在設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)適當(dāng)增加引物的長(zhǎng)度,理想的引物長(zhǎng)度為20-30堿基。另外為了減少由3′→5′外切酶活性引起的引物降解,盡量在冰上配制反應(yīng)體系,并后加入Pfu酶。
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