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Evagreen (20 × in water)

簡要描述：Evagreen (20 × in water)是一種用于實時定量PCR（qPCR）的DNA 結(jié)合染料。該染料的諸多優(yōu)點使它遠勝于SYBR Green I。除了有相似的光譜特性，Evagreen有三個主要特點使它區(qū)別于SYBR Green I 。

產(chǎn)品型號：AN19L032
廠商性質(zhì)：生產(chǎn)廠家
更新時間：2024-08-07
訪問量：1577

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PCR&q-PCR

RT-PCR PCR q-PCR 直擴PCR 核酸定量測定

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Evagreen ( 20 × in water )

產(chǎn)品描述
Evagreen 是一種用于實時定量PCR（qPCR）的DNA 結(jié)合染料。該染料的諸多優(yōu)點使它遠勝于SYBR Green I。除了有相似的光譜特性，Evagreen有三個主要特點使它區(qū)別于SYBR Green I 。
首先，Evagreen對PCR的抑制性遠小于SYBR Green I。因此，使用Evagreen進行的qPCR實驗可以使用快速PCR步驟。同時，Evagreen在實驗中可以使用較高的濃度，從而獲得遠強于SYBR Green I擴增信號。較高濃度的Evagreen也消除了“染料重分布"的缺陷，使Evagreen既可用于多重PCR，也可用于高分辨率（高清晰）熔解曲線分析（HRM）。該分析正被越來越多的用于PCR后的基因分型和異源雙鏈分析。由于SYBR Green I對PCR的抑制性，從而要求其使用濃度必須很低，因此SYBR Green I無法解決由低濃度造成的染料重分布問題，既不能用于多重PCR也不能用于HRM。同時，染料重分布問題也可能影響常規(guī)熔解曲線的可靠性，因為低熔點的DNA鏈可能由于這種原因而無法檢測到。
第二，Evagreen的穩(wěn)定性強。在正常的儲存、操作和PCR過程中不會被破壞。在緩沖溶液中的染料可以安全的儲存在室溫或冰箱里，也可以反復凍融。與之相反，SYBR Green I不穩(wěn)定而且降解后對PCR抑制性更強。
第三，Evagreen降低了細胞膜透性，因而比SYBR Green 1更加安全。獨立實驗室的測試結(jié)果顯示，Evagreen既沒有誘變性也沒有細胞毒性。相反，雖然SYBR Green I本身誘變性很弱，但它在細胞中可能抑制了正常DNA的修復機制，使其有誘變增強作用?？紤]到PCR的廣泛使用，其安全性應(yīng)該足夠重視。
訂購信息

產(chǎn)品名稱	貨號	規(guī)格
Evagreen (20 × in water)	AN19L032	1 mL
Evagreen (20 × in water)	AN19L033	5 mL

產(chǎn)品參數(shù)
λabs/λem = 500/530 nm (結(jié)合DNA)
λabs = 471 nm (未結(jié)合DNA)
運輸與保存
藍冰運輸。4℃短期避光保存，有效期12個月；-20℃長期避光保存，有效期24個月。
使用方法
如下建立實驗體系：（僅供參考）

名稱	體積
10× 的無Mg^2＋聚合酶緩沖液	5 µL
50 mM MgCl₂	2.5 µL
2 mM dNTP	5 µL
20×Evagreen	2.5 µL
Taq DNA polymerase	1-5 units
F, R Primers	各0.1-0.5 µM
模板	適量
dH₂O	to a final volume of 50 µL

實驗?zāi)康?/span>
實時定量PCR檢測20× Evagreen
主要試劑
1. Prime
hβ-actin：
forward 5’ -CACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’
reverse 5’-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’
2. HS Taq DNA Polymerase: Thermo(EP0612)
3. Glycerlo: Sigma(V900090-500 mL)
4. BSA: Sigma(A7030)
5. 10 mM dNTPs: Takara(4019)
實驗方案
1. 配制2× Evagreen Buffer

2× Evagreen Buffer
組分	濃度	體積（μL）
1 M Tris HCl pH8.5	50 mM	5
500 mM (NH4)₂SO₄	20 mM	4
50 mM MgCl₂	7 mM	14
50% glycerol	2.5%	5
DMSO	10 %	10
20× Evagreen	2×	10
10 mM dNTPs	0.4 mM	4
2 % Tween20	0.03 %	1.5
1 mg/mL BSA	22 ug/mL	2.2
H₂O	/	44.3
Total volume	/	100

2. 配制 q-PCR反應(yīng)體系

成分	20 μL/體系/管反應(yīng)
10 μM primers	1 μL
模板	適量
HS Taq DNA 酶（5 U/μL）	0.2 μL
2× Evagreen buffer	10 μL
H₂O	定容至20 μL

【注】：① DNA 模板的添加量通常在 100 ng 以下。因不同種類的 DNA模板中含有的靶基因的拷貝數(shù)不同，必要時可進行梯度稀釋，確定合適的 DNA 模板添加量。cDNA作為模板時的添加量不要超過 PCR 反應(yīng)液總體積的 10%。②引物終濃度一般控制在0.1-0.5 μM范圍內(nèi)。
3. 實驗分組：標準對照樣品孔（陽性對照）、檢測樣品孔、空白對照孔（陰性對照）共三組，同時進行檢測，分別進行三次平行實驗。
4. 混勻離心、上機進行熒光定量PCR（儀器為Roche：LC96）。
PCR程序：

	溫度	時間
Step 1	95℃	2 min
Step 2	95℃	5 sec
Step 3	60℃	30 sec
Step 2~3，重復 45個循環(huán)
熔解曲線Tm值 57℃~99℃

5. 保存數(shù)據(jù)，判斷樣本質(zhì)量：
A．檢測樣品與標準品之間的Ct值差
B．檢測樣品與標準品之間的熒光強度差
檢測結(jié)果需達到：以上兩組檢測指標無顯著性差異
注意事項

本產(chǎn)品僅限于科學實驗研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。

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